大家好，這裏是專注表觀組學十餘年，領跑多組學科研服務的易基因。
簡化甲基化測序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)是利用限制性內切酶對基因組進行酶切，富集啓動子及CpG島等重要的表觀調控區域並進行重亞硫酸鹽測序該技術顯著提高了高CpG區域的測序深度，在CpG島、啓動子區域和增強子元件區域可以獲得高精度的分辨率，是一種準確、高效、經濟的DNA甲基化研究方法，在大規模臨牀樣本的研究中具有廣泛的應用前景。
為適應科研技術的需要，易基因進一步開發了可在更大區域內捕獲CpG位點的雙酶切RRBS(dRRBS)，可研究更廣泛區域的甲基化，包括CGI shore等區域。
為助力適用低起始量DNA樣本（5ng）量多維度甲基化分析，易基因開發了富集覆蓋CpG島、啓動子、增強子、CTCF結合位點的甲基化靶向基因組測序方法：extended-representation bisulfite sequencing（XRBS），實現了高靈敏度和微量樣本複用檢測，使其具有高度可擴展性，並適用於有限的樣本和單個細胞基因組CG位點覆蓋高達15M以上。
技術優勢：
- 起始量：100ng gDNA；
- 單鹼基分辨率；
- 多樣本的覆蓋區域重複性可達到85%-95%、測序區域針對高CpG調控區域，數據利用率更高；
- 針對性強，成本較低；
- 基因組CG位點覆蓋高達10-15M，顯著優於850K芯片。
應用方向：
RRBS/dRRBS/XRBS廣泛應用於動物，要求全基因組掃描（覆蓋關鍵調控位點）的：
- 隊列研究、疾病分子分型、臨牀樣本的甲基化 Biomarker 篩選
- 複雜疾病及腫瘤發病機制等甲基化研究
- 模式動物發育和疾病甲基化研究
技術路線：
分析內容：
送樣要求：
技術指標：
經典案例
醫學方向項目文章：
RRBS揭示腸道對早產的快速適應涉及餵養相關的豬腸道基因DNA甲基化重編程
Gao F,et al.Rapid Gut Adaptation to Preterm Birth Involves Feeding-Related DNA Methylation Reprogramming of Intestinal Genes in Pigs. Front Immunol. 2020;11:565.
1、背景
早產後，未成熟的腸道功能和免疫功能必須迅速適應細菌定植和腸內餵養。但未成熟腸道的最佳飲食策略（如時間、飲食量和飲食類型）和最合適的細菌定植仍然未知。需要更好地理解未成熟腸道如何與環境因素（如營養和微生物）相互作用，以確定如何能確保早產兒對產後生活適應的早期餵養策略。
2、方法
作者為驗證腸道表觀遺傳變化與早產及首次餵養時的腸道反應有關，以仔豬為模型，對早產豬和足月豬進行全腸外營養（TPN）或部分腸內餵養5天，然後用牛奶進行純腸內餵養，直到第26天（斷奶年齡）。在第0天、第5天和第26天從總共10組豬中收集腸組織，比較分析早產豬和足月豬的腸道結構、功能、微生物組、DNA甲基化和基因表達（每組n=8）。
3、結論
RRBS結果顯示，出生時早產豬腸道出現絨毛萎縮和整體高甲基化，影響與Wnt信號通路相關基因。在生命的前5天，高甲基化相關的LBP（lipopolysaccharide binding protein）和TLR4（Toll-like receptor 4）通路基因表達明顯降低，但大多數早期甲基化差異在第26天消失。直到第26天，早產豬的蔗糖酶和麥芽糖酶活性仍然降低，腸道微生物羣發生改變。0-5天期間顯示許多新的甲基化差異，主要表現在未提供腸內餵養（TPN餵養）的情況下。這些甲基化差異影響了與細胞代謝相關的腸道基因，包括通過啓動子低甲基化增加GCK（葡萄糖激酶）表達。總之，未成熟腸道在早產後可迅速適應其基因甲基化和表達的能力，只有少數早產相關缺陷會持續到斷奶。結果表明早期腸內餵養對於刺激腸道基因甲基化重編程可能很重要，從而使腸道快速適應早產環境。
圖：早產豬和足月豬腸道的甲基化差異
農學方向經典案例：
不同孵化温度和CO2濃度中的雞心臟組織全基因組DNA甲基化評估
Corbett RJ, et al. Genome-Wide Assessment of DNA Methylation in Chicken Cardiac Tissue Exposed to Different Incubation Temperatures and CO2 Levels. Front Genet. 2020;11:558189.
1、背景：
孵化過程中的温度和CO2濃度對肉雞的發育有着深遠的影響。此前許多研究發現這些參數的差異對孵化心重 (heart weight，HW) 有顯著影響。早期生活環境也被證明會影響肉雞後期的生產性能，因此表觀遺傳機制可能介導環境刺激引起的長期生理變化。
2、方法：
利用RRBS技術評估84只在兩種不同蛋殼温度（EST；37.8℃和38.9℃）和三種CO2濃度（0.1%、0.4%和0.8%）下孵化的肉雞幼體心臟組織的DNA甲基化模式，並進行差異甲基化分析。
3、結論：
本研究利用RRBS技術驗證了ABLIM2、PITX2和THRSP三個基因的甲基化和表達的協調變化，確定孵化後小雞心臟的差異甲基化模式與孵化EST和CO2的差異有關，並且這種差異可能通過轉錄因子結合和基因表達的變化影響心臟的生長和發育。此外，本研究還鑑定了負責調節體温的其他器官（包括下丘腦和甲狀腺）的表觀遺傳模式可能有助於表徵調節心臟發育的温度驅動差異機制。總之，對早期生活環境影響的表觀遺傳特徵瞭解可以作為未來動物表現預測因子，從而有利於動物育種。
圖：RRBS繪製DNA甲基化圖譜
參考文獻：
- Gao F,et al.Rapid Gut Adaptation to Preterm Birth Involves Feeding-Related DNA Methylation Reprogramming of Intestinal Genes in Pigs. Front Immunol. 2020;11:565.
- Corbett RJ, et al. Genome-Wide Assessment of DNA Methylation in Chicken Cardiac Tissue Exposed to Different Incubation Temperatures and CO2 Levels. Front Genet. 2020;11:558189.
