基因變異普遍存在於同一物種內的不同個體中，如人與人之間的基因組是不完全一樣的（即是多態的），彼此之間都存在着一些差異，即使是和父母或是兄弟姐妹之間去比較。這種差異也是基因組多態性的來源，通過外在和內在特徵表現出來，比如頭髮和眼睛顏色，高矮胖瘦，抵抗力等。這些差異也是造成我們彼此之間不同的一個重要原因。

        基因變異是一個相對的概念，只有在彼此的比較中才有存在意義。基因變異主要分為三大類：

1. 單核苷酸變異，通常稱為單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism），就是單個DNA鹼基的不同，簡稱SNP；
2. 小的Indel（Insertion 和 Deletion的簡），指的是在基因組的某個位置上所發生的小片段序列的插入或者刪除，長度通常在50 bp以下；
3. 大的結構性變異，這種類型比較多，包括長度在50 bp以上的長片段序列的插入或者刪除、染色體倒位，染色體內部或染色體之間的序列易位，拷貝數變異，以及一些形式更為複雜的變異。

        為了和SNP變異作區分，第2和第3類變異通常也被稱為基因組結構性變異（Structural variation，簡稱SV）。

        結構變異長度少則幾十bp，多則幾萬bp，對其檢測帶來了極大挑戰。研究人員發現SV對基因組的影響比起SNP來説還要大，而且基因組上的SVs比起SNP而言，似乎更能用於解釋人類羣體多樣性的特徵。再者，一些SVs往往和一些疾病（包括癌症、自閉症、老年痴呆症）的發生相關聯，甚至還是其致病的誘因。因此對SVs進行檢測具有重要的意義。

        二代測序技術產生的序列雖然精度高，但讀段短（100~500 bp），不能跨越大多數長度較長的SVs區域，但基於單分子測序的三代測序技術（如PacBio，牛津納米孔測序）可以測得長達100 kpb的序列，輕鬆跨越各種SVs區域，為SVs檢測帶來方便。但其錯誤率較高（~15%），因此需要專門的SVs檢測算法。PBHoney是較早利用三代序列進行SVs檢測的軟件。

PBHoney方法

        PBHoney主要利用兩種序列比對情況進行檢測。如下圖所示，一種是Interrupted long-read mapping，一種是 Intra-read discordance。主要原因在於對於一條比對的三代序列，比對情況可以分為這兩種。

Interrupted long-read mapping 比對示意圖

        所謂Interrupted long-read mapping ，就是這條序列只比對了一部分，其前綴或者後綴的序列片段沒有比對上去。

        下圖是 Intra-read discordance比對示意圖，所謂 Intra-read discordance，就是整條序列都比對到參考基因組上，但某些比對區域由於SVs存在比對質量較低，存在較多非匹配狀態。

Intra-read discordance 比對示意圖

        PBHoney首先採用三代序列比對算法BLASR進行序列比對，然後針對這兩種比對情況做相應的處理，找出SVs區域。

處理 Interrupted long-read mapping序列

        首先將提取沒有比對的前綴或者後綴，如果長度大於200 bp，再將這些片段通過BLASR比對到參考基因組上。然後與原來比對的序列（initial alignment）組成piece-alignment，如下圖所示。後綴比對的片段稱為epilog，前綴比對的片段稱為prolog。        

然後對每個piece-alignment進行聚類處理：

1. 只考慮包含initial alignment 和 epilog （或prolog）的piece-alignment。如果epilog和prolog都存在，（如上圖3）所示，只考慮比對質量高的。
2. 保留initial alignment 和 epilog （或prolog）之間的距離小於200 bp的piece-alignment。200 bp是默認值，用户可自己設置。保留下來的piece-alignment稱為一個cluster。
3. SVs的位置（起始位置和結束位置）就是每個cluster中比對位置的平均值。如下圖所示。

處理 Intra-read discordance 序列

        對於完整比對上的序列，如上圖所示，通過以下步驟進行處理：

        1. 計算比對到基因組序列每個位置的替換（mismatch）、插入、刪除鹼基個數、及覆蓋率。構成一個4×G大小的數組A，其中G是參考基因組的序列長度。

        2. 然後計算基因組每個位置的錯誤率大小：

其中j=1,2,3,4. Ci表示覆蓋率。

        3. 通過下面公式對E矩陣進行變換：

        4. 再次對M矩陣進行變換：

        其中步驟3）和4）目的是尋找一些差異比較大的值，更好判斷是否是SV。

        下圖是通過以上步驟檢測一個刪除SV的示意圖。可以看出步驟3）和4）可以將A柱狀圖轉變成脈衝信號，方便SV檢測。

結果

        下表是PBHoney的檢測結果，可以看出其靈敏度和PPV值還是不錯的，這篇文章是以軟件類（software）形式發表的，沒有和別的方法進行比較。

總結

        SVs檢測對於疾病治療具有重要意義，隨着三代測序技術的不斷髮展，其測序準確性和序列長度會不斷改善，相信基於三代序列的結構變異檢測會得到越來越多的關注。

參考文獻

• English A C, Salerno W J, Reid J G. PBHoney: identifying genomic variants via long-read discordance and interrupted mapping. BMC bioinformatics, 2014, 15(1): 180.
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