重組蛋白技術是現代生命科學研究的核心工具之一，廣泛應用於結構生物學、藥物篩選、信號通路研究及酶動力學分析等領域。作為生物科技企業，我們專注於為科研工作者提供高質量的重組蛋白定製服務。本文將從技術流程的角度，系統介紹重組蛋白表達純化的核心步驟，幫助讀者全面理解從基因序列到高純度蛋白的製備路徑。

一、表達系統選擇：匹配目標蛋白特性

重組蛋白製備的首要環節是選擇適合的表達系統。常見的表達系統包括大腸桿菌表達系統、哺乳動物細胞表達系統、昆蟲細胞表達系統及酵母表達系統。不同系統在表達效率、蛋白摺疊修飾及成本方面各有特點：

大腸桿菌系統適用於無需複雜修飾的蛋白，具有周期短、產量高的優勢；

哺乳動物細胞系統可完成糖基化等翻譯後修飾，更接近天然蛋白構象；

昆蟲細胞系統在蛋白摺疊與修飾能力上介於原核與真核系統之間。

科研人員需根據目標蛋白的理化性質（如分子量、二硫鍵、修飾需求）選擇最佳表達宿主。

二、質粒構建與轉化：基因載體的精準設計

在確定表達系統後，需將目標基因克隆至表達載體中。載體通常包含啓動子（如T7、CMV）、標籤序列（如His標籤、GST標籤）及篩選標記（如氨苄抗性）。通過酶切連接或重組技術將基因插入載體，並經測序驗證序列正確性。驗證後的質粒通過轉化（原核系統）或轉染（真核系統）導入宿主細胞，啓動蛋白表達。

三、蛋白表達與誘導：可控表達的條件優化

為獲得可溶性高、活性強的蛋白，需對錶達條件進行精細調控：

誘導條件：通過添加IPTG（原核系統）或改變温度、血清濃度（真核系統）啓動表達；

表達時間：根據蛋白積累曲線確定最佳收穫時間，避免包涵體形成；

細胞裂解：採用超聲、高壓均質或酶解法破碎細胞，釋放胞內蛋白。

四、蛋白純化：標籤與層析技術的應用

純化是獲得高純度蛋白的關鍵步驟。根據載體設計的標籤，選擇對應的層析方法：

親和層析：

His標籤蛋白：通過鎳柱或鈷柱與組氨酸殘基特異性結合，咪唑洗脱；

GST標籤蛋白：利用谷胱甘肽瓊脂糖樹脂捕獲，還原型谷胱甘肽競爭性洗脱；

Protein A/G標籤：適用於抗體及FC融合蛋白的純化。

離子交換與分子篩層析：
進一步去除雜質並提高純度。離子交換層析（如DEAE、SP柱）基於電荷差異分離蛋白，分子篩層析（尺寸排阻層析）則按分子大小分級洗脱。

五、蛋白濃縮與緩衝液置換

純化後的蛋白常需濃縮至目標濃度，並通過超濾或透析更換至儲存緩衝液（如PBS、Tris-HCl）。此步驟可去除鹽離子、咪唑等雜質，提高蛋白穩定性。

六、質量檢測：純度與活性的雙重驗證

最終蛋白需通過多種技術驗證其質量：

SDS-PAGE：檢測純度與分子量；

Western Blot：通過標籤抗體確認蛋白特異性；

HPLC分析：定量評估純度；

活性檢測：如酶動力學分析或細胞功能實驗。

七、蛋白儲存與穩定性保障

分裝後的蛋白需在-80°C長期保存，避免反覆凍融。添加甘油或海藻糖可增強穩定性，緩衝液pH與鹽濃度需根據蛋白特性優化。